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765 隐蔽狡猾善变（第2页）

MDSCs的两个亚群之间的比例取决于特定的肿瘤模型和微环境。

为了监测同源LLC模型中MDSC的丰度，我们通过免疫表型分析确定了接种后肿瘤的生长以及LLC小鼠中不同时间点的总体MDSC及其亚群。

如图1C所示，肿瘤组织中总MDSCs的百分比随着肿瘤的发展而稳步增加，从接种后第一周肿瘤浸润淋巴细胞的不到10%（5.84±1.22%）上升到第四周超过20%（21.71±3.22%）（P<0.01）。

在我们的LLC模型中，PMN-MDSCs占总MDSCs的94.94±8.47%，并且与总MDSCs具有相同的肿瘤发展趋势（P<0.05）。

对亚群进行分析，虽然M-MDSCs增加了大约5倍，但差异没有统计学意义。

为了更好地了解MDSCs的全身分布，我们还研究了MDSCs在外周血、脾脏和骨髓中的比例。

仅在接种LLC细胞一周后，TB小鼠外周血中的MDSC百分比是无瘤小鼠的两倍（27.33±4.62%vs.12.48±0.93%，P<0.05），3周后的MDSC百分比是无瘤小鼠的5倍（27.33±4.62%vs.12.48±0.93%，P<0.05）。

TB小鼠外周血中PMN-MDSCs的比例也增加，而M-MDSCs的比例与肿瘤大小无关。

PD-L1是肿瘤细胞、MDSCs、巨噬细胞和树突状细胞表达的最重要的检查点分子之一。

为了确定TB小鼠MDSCs的PD-L1表达是否与健康小鼠不同，我们通过流式细胞术测试了MDSCs的PD-L1表达。

结果表明，TME中MDSCs上PD-L1的平均荧光强度（MFI）从在LLC细胞接种后的第一周386.8±100.9a.u逐渐增加到第四周的1，068.0±121.8a.u（P<0.01），这表明PD-L1在我们模型中的MDSC中具有潜在作用。

在脾脏和骨髓中，随着肿瘤的发展，MDSCs的比例也显著增加，其模式与肿瘤组织和外周血中的MDSCs相同。

此外，我们在TB小鼠中观察到明显的脾肿大，这与我们观察到的MDSCs在脾内聚集一致。

为了确定局部照射对肿瘤生长和MDSCs的影响，当肿瘤直径达到7.5mm时，我们使用大分割RT（20GyF）治疗皮下LLC肿瘤。

放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为500mm3，但此后肿瘤开始再生。

根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。

肿瘤组织苏木精-伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。

随后的CD11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是CD11b+髓系细胞，这表明局部照射可能导致MDSCs的积累。

为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总MDSCs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。

局部照射后，放疗后肿瘤浸润MDSCs的比例比未治疗肿瘤高2倍（ctrlvs.RT=21.33±3.29%vs.44.10±3.00%，P<0.001）。

PMN-MDSCs与总MDSCs具有相同的增加趋势（ctrlvs.RT=16.37±2.47%vs.38.66±4.24%，P<0.001），而M-MDSC比例保持在约0.1%，且与肿瘤大小和治疗无关。

外周血情况同肿瘤组织。

为了确定受照射肿瘤中PMN-MDSC的逐渐积累是否有助于LLC肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗Ly-6G单克隆抗体来消耗MDSC.抗Ly-6G抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中PMN-MDSC的频率（P<0.05）。

此外，用抗Ly-6G抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明PMN-MDSC的募集对肿瘤再生至关重要。

虽然PMN-MDSCs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对CD8+T细胞的抑制无疑是最重要的。

为了确定RT后PMN-MDSCs诱导的免疫抑制是否依赖于CD8+T细胞，我们通过流式细胞术评估了CD8+T细胞的数量和功能。

如图3D所示，CD8+T细胞的百分比随着照射从11.71±2.31%下降到2.42±0.62%（P<0.01）。

PMN-MDSC耗竭逆转了这种下降（RTvs.RT+anti-Ly-6G抗体=2.42±0.62%vs.20.12±3.92%，P<0.01）。

为了更好地了解CD8+T细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了CD8+T细胞内部和表面上IFN-γ、CD28和PD-1的表达。

局部RT显着降低了CD8+T细胞分泌IFN-γ的比例，从33.064.53%降至13.252.08%，并增加了表达PD-1的CD8+T细胞的比例（ctrlvs.RT=253.20±57.03auvs.538.80±98.76）au，P<0.05）。

CD28表达未观察到显着变化。

当抗Ly-6G抗体被给予辐照小鼠时，IFN-γ分泌达到与未处理的LLC小鼠相同的水平（29.74±3.55%），而与辐照小鼠进行比较抗Ly-6G抗体处理后的PD-1表达没有变化小鼠。

因此，在这部分我们建议PMN-MDSCs通过抑制CD8+T细胞促进放疗后肿瘤的再生。

PMN-MDSCs不仅抑制了TME中CD8+T细胞的数量，而且还抑制了其活性。

为了确定辐照诱导MDSCs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及iNOS和ARG1活性检测。

肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部RT增强了ARG1的表达，但没有增强iNOS的表达。